mekanisme kerja obat pada molekul pembawa

PENDAHULUAN

        Obat adalah semua zat baik kimiawi, hewani, maupun nabati, yang dalam dosis layak dapat menyembuhkan, meringankan atau mencegah penyakit atau gejala-gejalanya. Obat juga disebut suatu bahan atau paduan bahan yang digunakan untuk mempengarui atau menyelidiki sistem fisiologi atau keadaan patologi dalam rangka penetapan diagnosa, pencegahan penyakit, penyembuhan penyakit, pemulihan, atau peningkatan kesehatan termasuk kontrasepsi dan sediaan biologis. Suatu obat dapat digunakan untuk menetapkan diagnosis, mencegah penyakit,mengurangi dan menghilangkan penyakit atau gejala penyakit, menyembuhkan penyakit, bahkan memperelok dan memperindah badan atau bagian badan manusia. Perkembangan obat diawali dari mulai menyerupai hewan meniru perlakuan hewan dalam melakukan pengobatan, empiric dan magic (botani spiritual, pengobatan dengan botani, senyawa kimia, hingga saat ini menjadi sediaan farmasi obat). Seiring dengan perkembangan zaman dan kemajuan teknologi, saat ini terdapat bermacam-macam obat, dari mulai bentuk, fungsi hingga cara kerjanya yang semakin spesifik. Dalam hal ini kami lebih spesifik dalam membahas cara kerja obat, terutama obat yang bekerja dalam sistem transport. Maka dari itu, hal yang akan kami bahas adalah mengenai obat yang bekerja pada sistem transport.

      Banyaknya molekul yang masuk dan keluar membran menyebabkan terciptanya lalu lintas membran. Molekul yang dapat melewati membran sel antara lain ialah molekul hidrofobik (CO₂, O₂), dan molekul polar yang sangat kecil (air, etanol). Sementara itu, molekul lainnya seperti molekul polar dengan ukuran besar (glukosa), ion, dan substansi hidrofilik membutuhkan mekanisme khusus agar dapat masuk ke dalam sel.

         Lalu lintas membran digolongkan menjadi dua cara, yaitu dengan transpor pasif untuk molekul-molekul yang mampu melalui membran tanpa mekanisme khusus dan transpor aktif untuk molekul yang membutuhkan mekanisme khusus. Lalu lintas membran akan membuat perbedaan konsentrasi ion sebagai akibat dari dua proses yang berbeda yaitu difusi dan transpor aktif, yang dikenal sebagai gradien ion. Lebih lanjut, gradien ion tersebut membuat sel memiliki tegangan listrik seluler. Dalam keadaan istirahat, sitoplasma sel memiliki tegangan antara 30 hingga 100 mV lebih rendah daripada interstitium.

jalur metabolisme sekunder

         Metabolit sekunder merupakan bahan kedua yang sebenarnya tidaklah seesensial yang pertama dalam keberadaan organisme. Namun metabolit ini sering berperan penting dalam mempertahankan kehidupan organisme. Sebagai contoh, bahan kimia untuk pertahanan (detoksifikasi), penarik lawan jenis dan yang memungkinkan seekor hewan berkomunikasi dengan anggota lainnya.Bahan-bahan ini dapat berupa terpen, alkoloid atau pun pigmen.   .
         Biosintesis metabolit sekunder sangat beragam tergantung dari goIongan senyawa yang bersangkutan. Jalur yang biasanya dilalui dalam pembentukan metabolit sekunder ada tiga jalur, yaitu jalur asam asetat, jalur asam sikimat, dan jalur asarn mevalonat.

1.                   Jalur asam asetat

         Asam asetat, asam etanoat atau asam cuka adalah senyawa kimia asam organik yang dikenal sebagai pemberi rasa asam dan aroma dalam makanan. Asam cuka memiliki rumus empiris C₂H₄O₂. Rumus ini seringkali ditulis dalam bentuk CH₃–COOH, CH₃COOH, atau CH₃CO₂H. Asam asetat pekat (disebut asam asetat glasial) adalah cairan higroskopis tak berwarna, dan memiliki titik beku 16,7°C. Cuka mengandung 3–9% volume asam asetat, menjadikannya asam asetat adalah komponen utama cuka selain air. Asam asetat berasa asam dan berbau menyengat. Selain diproduksi untuk cuka konsumsi rumah tangga, asam asetat juga diproduksi sebagai prekursor untuk polivinil asetat dan selulosa asetat. Meskipun digolongkan sebagai asam lemah, asam asetat pekat bersifat korosif dan dapat menyerang kulit.

         Asam asetat merupakan salah satu asam karboksilat paling sederhana, setelah asam format. Larutan asam asetat dalam air merupakan sebuah asam lemah, artinya hanya terdisosiasi sebagian menjadi ion H⁺ dan CH₃COO^–. Asam asetat merupakan pereaksi kimia dan bahan baku industri yang penting. Asam asetat digunakan dalam produksi polimer seperti polietilena tereftalat, selulosa asetat, dan polivinil asetat, maupun berbagai macam serat dan kain. Dalam industri makanan, asam asetat, dengan kode aditif makanan E260, digunakan sebagai pengatur keasaman. Di rumah tangga, asam asetat encer juga sering digunakan sebagai pelunak air. Sebagai aditif makanan, asam asetat disetujui penggunaannya di banyak negara, termasuk Kanada, Uni Eropa, Amerika Serikat, Australia dan Selandia Baru.

         Poliketida meliputi golongan yang besar bahan alami yang digolongkan bersarna berdasarkan pada biosintesisnya.Keanekaragaman struktur dapat dijelaskan sebagai turunan rantai poli-ß-keto,terbentuk oleh koupling unit-unit asam asetat (C2)via reaksik ondensas, misalnya n CH3CO2H [CH3C0]n -


         Termasuk poliketida adalah asam temak, poliasetilena, prostaglandin, antibiotika makrolida, dan senyawa aromatik seperti antrakinon dan tetrasiklina. Pembentukan rantai poli-ß-keto dapat digambarkan sebagai sederet reaksi Claisen, keragaman melibatkan urutan ß-oksidasi dalam metabolisme asam lemak. Jadi, 2 molekul asetil-KoA dapat ikut serta datam reaksi Claisen membentuk asetoasetil-KoA, kemudian reaksi dapat berlanjut sampai dihasilkan rantai poli-ß-keto yang cukup . Akan tetapi studi tentang enzim yang terlibat dalam biosintesis asam Iemak belum terungkap secara rinci. Namun demikian, dalam pembentukan asam lemak melibatkan enzim asam Iemak sintase seperti yang dibahas di atas.

2.                  Jalur asam sikimat

         Jalur asam sikimat merupakan jafur alternatif menuju senyawa aromatik, utamanya L-fenilalanin. L-tirosina. dan L-triptofan. Jalur ini berlangsung dalam mikroorganisme dan tumbuhan, tetapi tidak berlangsung dalam hewan, sehingga asam amino aromatik merupakan asam amino esensial yang harus terdapat dalam diet manusia maupun hewan. Zantara pusat adalah asam sikimat, suatu asam yang ditemukan dalam tanaman IlIicium sp. beberapa tahun sebelum perannya dalam metabolisme ditemukan. Asam ini juga terbentuk dalam mutan tertentu dari Escherichia coli.Dalam biosintesis L-triptofan dan asam 4-hidroksibenzoat juga terjadi zantara asam korismat.

         Kombinasi dari jalur shikimate dan jalur asetat bertanggung jawab untuk biosintesis dari styrylpyrones, flavonoid dan stilbenes, flavonolignans, dan isoflavonoid. Kuinon terpenoid dibentuk oleh kombinasi dari jalur shikimate dengan jalur terpenoid. topik monografi memberikan informasi lebih rinci tentang agen obat termasuk asam folat, kloramfenikol, podofilum, minyak atsiri, dicoumarol dan warfarin, psoralens, kava, Silybum marianum, phyto-estrogen, derris dan lonchocarpus, vitamin E, dan vitamin K. Jalur shikimate menyediakan alternatif rute ke senyawa aromatik, khususnya aromatik Asam amino L-fenilalanin, tirosin L- dan L-triptofan. Jalur ini digunakan oleh mikroorganisme dan tanaman, tetapi tidak oleh hewan, dan dengan demikian asam amino aromatik termasuk asam amino esensial bagi manusia yang harus diperoleh dalam makanan. Jalur asam shikimat (Gambar), diperoleh dari suatu senyawa yang telah diisolasi dari tanaman spesies Illicium (Jepang 'Shikimi') bertahun-tahun sebelum perannya dalam metabolisme telah ditemukan. Sebagian besar zat antara di jalur ini diidentifikasi oleh studi yang cermat dengan serangkaian Escherichia coli mutan yang disiapkan oleh Iradiasi UV.

         Kebutuhan gizi mereka untuk pertumbuhan, dan setiap produk sampingan yang terbentuk, kemudian ditandai. Sebuah strain mutan yang mampu tumbuh biasanya berbeda dari induknya hanya satu gen, dan efek yang biasa adalah sintesis terganggu oleh enzim tunggal. Biasanya, mutan diblokir dalam transformasi senyawa A ke senyawa B akan memerlukan B untuk pertumbuhan sementara mengumpulkan A dalam medium. dalam hal ini cara, jalur dari fosfoenolpiruvat (dari glikolisis) dan D-erythrose 4-fosfat (dari siklus pentosa fosfat) ke amino aromatik asam itu luas diuraikan. fenilalanin dan
tirosin membentuk dasar C6C3 fenilpropana unit ditemukan di banyak produk alami,misalnya sinamat asam, kumarin, lignan, dan flavonoid, dan bersama dengan triptofan merupakan prekursor dari lebar berbagai struktur alkaloid. Selain itu, ditemukan bahwa banyak turunan asam benzoat sederhana, mis asam galat (Gambar) dan asam p-aminobenzoic (Asam 4-aminobenzoic)  yang diproduksi melalui branchpoints di jalur shikimate

         Jalur  shikimate dimulai dengan kopling dari fosfoenolpiruvat (PEP) dan D-erythrose 4-fosfat untuk memberikan tujuh karbon 3-deoxy-D-arabino heptulosonic asam 7-fosfat (DAHP) (Gambar). Reaksi ini, yang ditampilkan di sini sebagai aldol-jenis kondensasi, dikenal secara mekanis lebih kompleks dalam versi enzim-katalis ; beberapa transformasi lain dalam jalur ini juga telah ditemukan untuk menjadi kompleks. Penghapusan asam fosfat dari DAHP diikuti oleh reaksi aldol intramolekul menghasilkan pertama 3- menengah karbosiklik asam dehydroquinic. Namun, ini juga merupakan terlalu menyederhanakan.

         Penghapusan fosfat asam sebenarnya mengikuti suatu NAD + -tergantung oksidasi hidroksil pusat, dan ini kemudian kembali terbentuk dalam reaksi reduksi tergantung NADH pada senyawa karbonil antara sebelum dengan reaksi aldol terjadi. Semua perubahan ini terjadi dengan adanya enzim tunggal. pengurangan asam 3-dehydroquinic menghasilkan  asam Quinic, produk alami cukup umum ditemukan di bentuk bebas, seperti ester, atau dalam kombinasi dengan alkaloid seperti kina. Asam Shikimic sendiri terbentuk dari 3-dehydroquinic asam melalui asam 3-dehydroshikimic oleh dehidrasi dan langkah pengurangan. Sederhana asam fenolat protocatechuic asam (asam 3,4-Dihydroxybenzoic) dan asam galat (asam 3,4,5-rihydroxybenzoic) dapat dibentuk oleh reaksi branchpoint dari 3-dehydroshikimic asam, yang melibatkan dehidrasi dan enolization, atau, dalam kasus asam gallic, dehidrogenasi dan enolization. Fitur asam galat sebagai komponen dari banyak bahan tanin (gallotannins), mis pentagalloylglucose, ditemukan pada tumbuhan, bahan yang telah digunakan selama ribuan tahun dalam penyamakan hewan menyembunyikan membuat kulit, karena kemampuan mereka untuk crossling molekul protein. Tanin juga berkontribusi terhadap yang astringency makanan dan minuman, terutama teh, kopi dan anggur.

 

 3.     Jalur asam mevalonat

         Terpenoid merupakan bentuk senyawa dengan keragaman struktur yang besar dalam produk alami yang diturunkan dan unit isoprena (C5) yang bergandengan dalam model kepala ke ekor (head-to-tail), sedangkan unit isoprena diturunkan dari metabolisme asam asetat oleh jalur asam mevalonat (mevalonic acid : MVA).

         Mekanisme dari tahap-tahap reaksi biosintesis terpenoid adalah asam asetat setelah diaktifkan oleh koenzim A melakukan kondensasi jenis Claisen menghasilkan asam asetoasetat. Senyawa yang dihasilkan ini dengan asetil koenzim A melakukan kondensasi jenis aldol menghasilkan rantai karbon bercabang sebagaimana ditemukan pada asam mevalinat, reaksi-reaksi berikutnya adalah fosforialsi,eliminasi asam fosfat dan dekarboksilasi menghasilkan isopentenil (IPP) yangselanjutnya berisomerisasi menjadi dimetil alil piropospat (DMAPP) oleh enzimisomeriasi. IPP sebagai unti isoprene aktif bergabung secara kepala ke ekordengan DMAPP dan penggabungan ini merupakan langkah pertama dari polimerisasi isoprene untuk menghasilkan terpenoid.Penggabungan ini terjadi karena serangan electron dari ikatan rangkap IPPterhadap atom karbon dari DMAPP yang kekurangan electron diikuti olehpenyingkiran ion pirofosfat yang menghasilkan geranil.pirofosfat (GPP) yaitusenyawa antara bagi semua senyawa monoterpenoid.Penggabungan selanjutnya antara satu unti IPP dan GPP dengan menaismeyang sama menghasilkan Farnesil pirofosfat (FPP) yang merupakan senyawaantara bagi semua senyawa seskuiterpenoid. Senyawa diterpenoid diturunkan dariGeranil-Geranil Pirofosfat (GGPP) yang berasal dari kondensasi antara satu untiIPP dan GPP dengan mekanisme yang sama.

         Secara umum biosintesa dari terpenoid terjadi 3 reaksi dasar yaitu:
1.Pembentukan isoprene aktif berasal dari asam asetat melalui asam mevalonat.
2.Penggabungan kepala dan ekor dua unit isoprene akan membentuk mono-,seskui-, di-. sester-, dan poli-terpenoid.

3.Penggabungan ekor dan ekor dari unit C-15 atau C-20 menghasilkan triterpenoid dan steroid. 

jalur pembentukan sekunder

1. JaIur asam asetat

Poliketida meliputi golongan yang besar bahan alami yang digolongkan bersarna berdasarkan pada biosintesisnya. Keanekaragaman struktur dapat dijelaskan sebagai turunan rantai poli-ß-keto, terbentuk oleh koupling unit-unit asam asetat (C2) via reaksi kondensasi, misalnya

n CH3CO2H [CH3C0]n -

Termasuk poliketida adalah asam temak, poliasetilena, prostaglandin, antibiotika makrolida, dan senyawa aromatik seperti antrakinon dan tetrasiklina. Pembentukan rantai poli-ß-keto dapat digambarkan sebagai sederet reaksi Claisen, keragaman melibatkan urutan ß-oksidasi dalam metabolisme asam lemak. Jadi, 2 molekul asetil-KoA dapat ikut serta datam reaksi Claisen membentuk asetoasetil-KoA, kemudian reaksi dapat berlanjut sampai dihasilkan rantai poli-ß-keto yang cukup (Gambar 3—7). Akan tetapi studi tentang enzim yang terlibat dalam biosintesis asam Iemak belum terungkap secara rinci. Namun demikian, dalam pembentukan asam lemak melibatkan enzim asam Iemak sintase seperti yang dibahas di atas.

Mengenai reaksi-reaksi yang terjadi pada jalur asam asetat tercantum dalam Gambar 3—6.

2. Jalur asam sikimat

Jalur asam sikimat merupakan jafur alternatif menuju senyawa aromatik, utamanya L-fenilalanin. L-tirosina. dan L-triptofan. Jalur ini berlangsung dalam mikroorganisme dan tumbuhan, tetapi tidak berlangsung dalam hewan, sehingga asam amino aromatik merupakan asam amino

esensial yang harus terdapat dalam diet manusia maupun hewan. Zantara pusat adalah asam sikimat, suatu asam yang ditemukan dalam tanaman IlIicium sp. beberapa tahun sebelum perannya dalam metabolisme ditemukan. Asam ini juga terbentuk dalam mutan tertentu dari Escherichia coli. Adapun contoh reaksi yang terjadi dalam biosintesis asam polifenolat tercantum dalam Gambar 3 — 7. Dalam biosintesis L-triptofan dan asam 4-hidroksibenzoat juga terjadi zantara asam korismat.

3. Jalur asam mevalonat

Terpenoid merupakan bentuk senyawa dengan keragaman struktur yang besar dalam produk alami yang diturunkan dan unit isoprena (C5) yang bergandengan dalam model kepala ke ekor (head-to-tail), sedangkan unit isoprena diturunkan dari metabolisme asam asetat oleh jalur asam mevalonat (mevalonic acid : MVA).

metabolit bahan alam

I. METABOLIT PRIMER DAN METABOLIT SEKUNDER

Kimia organik Bahan alam adalah ilmu kimia senyawa atau molekul yang berasal dari sumber daya alam hayati: Tumbuhan, hewan, dan mikroorganisme teresterial, dan laut. Yang membahas tentang :

1.      Struktur dasarnya,

2.      Terdapatnya / biosintesisnya

3.      Sifat-sifatnya,

4.      Reaksi pengenalan.

Senyawa organik bahan alam umumnya terdiri atas 2 yaitu :

Metabolik primer Produk metabolis primer : sama untuk semua organisme Contoh :     Polimer alam     Polisakarida      Protein     Lemak     Asam Nukleat

Metabolik sekunder Produk metabolism sekunder : bergantung pada spesies Contoh :       Terpenoid       Steroid       Flavonoid        Poliketida       Alkaloid

        

a. Metabolit Primer

            Senyawa yang secara langsung memiliki fungsi/terlibat dalam proses metabolisme utama, jalur katabolisme dan anabolisme pada makhluk hidup. .

b. Metabolit  Sekunder

            Senyawa yang tidak memiliki fungsi untuk pertumbuhan dan perkembangan secara langsung, dimana senyawa tersebut penting untuk kelangsungan hidup dan interaksi dengan lingkungan.

Beberapa fungsi metabolit sekunder :

1. Proteksi terhadap serangan mikroba, seperti :

• fitoaleksin, senyawa pertahanan yang dapat diinduksi

- struktur bermacam-macam

- disintesis di dalam sel di sekitar sel yang terinfeksi

- terakumulasi dalam konsentrasi yang tinggi pada sel yang mati

• elisitor-senyawa kimia spesifik yang menginduksi respons mekanisme pertahanan tumbuhan

2. Proteksi terhadap serangan/gangguan herbivora

• umumnya bersifat konstitutif
• pestisida alami pada tumbuhan dapat mencapi 10% berat kering, dimana tumbuhan liar memiliki potensi sebagai toksin.

3. Proteksi terhadap gangguan lingkungan

• proteksi terhadap UV, contoh : antosianin, kutikula
• osmoproteksi, contoh  : prolin, glisin, betain

4. Agen alelopati, menghambat pertumbuhan tanaman di sekitarnya (kompetisi)

5. Menarik serangga pollinator dan hewan herbivora untuk membantu penyebaran biji seperti pigmen, minyak wangi dan biji seringkali terlindungi oleh adanya toksin.

JALUR METABOLISME SEKUNDER

c. Karakteristik Senyawa Organik Bahan Alam

METABOLIT PRIMER

1.      Tersebar merata dalam tiap organisme

2.      Fungsi universil, sumber energi, enzim, pengemban keturunan, dan bahan struktur

3.      Perbedaan struktur kimia kecil

4.      keaktifan fisiologis berkaitan dengan struktur kimia

METABOLIT SEKUNDER

1.   Tersebar tidak merata dalam tiap organisme

2.   Fungsi ekologis; penarik serangga, pelindung diri, alat bersaing, hormon.

3.    Struktur kimia berbeda-beda

4.    Keaktifan fisiologis berkaitan dengan struktur kimia

II. METODE ISOLASI DAN BIOAKTIFITAS SENYAWA ORGANIK BAHAN ALAM

a. Metode isolasi

1.      Infundasi

Definisi :

      Sediaan cair yang dibuat  dengan mengekstraksi simplisia nabati dengan  air suhu 90^oC selama 15 menit.

Cara pembuatan:

Campur simplisia dengan air secukupnya, panaskan di atas penangas air selama15 menit terhitung mula isuhu mencapai 90 ^oC sambil sekali-kali diaduk. Saring selagi panas melalui kain flanel, tambahkan air panas secukupnya melalui ampas hingga diperoleh volume infuse yang dikehendaki.

2.   Maserasi

      Maserasi merupakan proses perendaman sampel dengan pelarut organik yang digunakan pada temperatur ruangan. Proses ini sangat menguntungkan dalam isolasi senyawa bahan alam karena dengan perendaman sampel tumbuhan akan terjadi pemecahan dinding dan membran sel akibat perbedaan tekanan antara di dalam dan di luar sel, sehingga metabolit sekunder yang ada dalam sitoplasma akan terlarut dalam pelarut organik. Selain itu ekstraksi senyawa akan sempurna karena dapat diatur waktu perendaman yang dilakukan. Pemilihan pelarut untuk proses maserasi akan memberikan efektifitas yang tinggi dengan memperhatikan kelarutan senyawa bahan alam pelarut tersebut. Secara umum pelarut metanol merupakan pelarut yang paling banyak digunakan dalam proses isolasi senyawa organik bahan alam karena dapat melarutkan seluruh golongan metabolit sekunder. Kelemahan isolasi dengan maserasi adalah waktu pengerjaan lama dan penyarian kurang sempurna.

      Macam-macam Maserasi :

      a. Digesti

          - maserasi dengan pemanasan 40-50⁰C

          - hanya untuk senyawa tahan panas

          - keuntungan : kekentalan kurang, daya larut naik, kecepatan difusi naik

      b. Maserasi dengan pengaduk kontinue

          - mengurangi waktu hingga menjadi 6-24 jam

      c. Remaserasi

          - maserasi beberapa kali

      d. Maserasi melingkar

         - cairan penyari selalu bergerak dan menyebar

      e. Maserasi melingkar bertingkat

         - untuk mendapatkan penyarian yang sempurna

3.   Perkolasi

      Definisi :

      Penyarian yang dilakukan dg  mengalirkan cairan penyari melalui serbuk simplisia yang telah dibasahi.

      Cara kerja:

      Serbuk simplisia ditempatkan dalam suatu bejana silinder, yang bagian bawahnya diberi sekat berpori. Cairan penyari dialirkan dari atas ke bawah melalui serbuk tersebut, cairan penyari akan melarutkan zat aktif sel-sel yang dilalui sampai mencapai keadaan jenuh. Cairan akan bergerak ke bawah karena beratnya sendiri dan cairan di atasnya.

4.  Penyarian bertingkat (Sokletasi)

      Cara Kerja :

Penyari diisikan pada labu, serbuk simplisia diisikan pd tabung dari kertas saring. Cairan penyari diuapkan hingga mendidih,uap penyari akan naik keatas melalui serbuk simplisia dan uap penyari akan mengembun karena didinginkan dengan pendingin balik. Embun turun dalam simplisia dan melarutkan zat aktif dan kembali ke dalam labu. Cairan menguap kembali dan berulang proses di atas.

5.   Ekstrak

Definisi :

Sediaan pekat yang diperoleh dengan mengekstraksi zat aktif dari simplisia nabati atau simplisia hewani menggunakan pelarut yang sesuai, kemudian semua atau hampir semua pelarut diuapkan dan massa atau serbuk yang tersisa diperlakukan sedimikian hingga memenuhi bahan baku yang telah ditetapkan.

Cara pembuatan :

Sebagian besar ekstrak dibuat dengan ekstraksi bahan baku obat secara perkolasi. Seluruh perkolat biasanya dipekatkan dengan cara destilasi dengan pengurangan tekanan, agar bahan utama obat sesedikit mungkin terkena panas.

6.   Ekstrak cair

Sediaan cair simplisia nabati yang mengandung etanol sebagai pelarut atau sebagai pengawet atau sebagai pelarut dan pengawet. Jika tidak dinyatakan lain pada masing-masing monografi, tiap ml ekstrak mengandung bahan aktif 1g simplisia yang memenuhi syarat. Ekstrak cair yang cenderung membentuk endapan dapat didiamkan dan disaring.

 b. Metode Fraksinasi:

Kromatografi

      Penggunaan kromatografi sangat membantu dalam pedeteksian senyawa metabolit sekunder dan dapat dijadikan sebagai patokan untuk proses pengerjaan berikutnya dalam menentukan struktur senyawa.

Hasil yang diperoleh dari isolasi baik berupa ekstrak, destilat,perkolat dll dideteksi jumlah kompenen senyawa yang terkandung di dalamnya menggunakan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) preparatif atau plat KLT siap pakai. Terjadinya pemisahan komponen-komponen pada KLT dengan Rf tertentu dapat dijadikan sebagai panduan untuk memisahkan komponen kimia tersebut dengan menggunakan kolom kromatografi (KKG, KKV, KKT dll) dan sebagai fasa diam dapat digunakan silikagel dan eluen (fasa gerak) yang digunakan berdasarkan hasil yang diperoleh dari KLT dan akan lebih baik bila kepolaran eluen pada kolom kromatografi sedikit di bawah kepolaran eluen pada KLT.

      Pemilihan eluen sebaiknya dimulai dari pelarut organik non polar seperti n-heksan dan ditingkatkan kepolarannya seperti menggunakan etil asetat, kloform atau dikloro metan (DCM). Proses fraksinasi ini dilakukan berulang kali hingga diperoleh senyawa murni. Senyawa murni diketahui dengan jelas bila telah dideteksi dengan KLT menggunakan 3 sistem eluen menunjukkan satu noda. Selain dengan KLT kemurnian suatu senyawa dapat dilakukan dengan penentuan titik lelehnya dimana range titik lelehnya tidak lebih dari satu.

KOLOM KROMATOGRAFI

c. Identifikasi Senyawa dan Penentuan Struktur

                  Senyawa bahan alam hasil isolasi dan fraksinasi selanjutnya diidentifikasi  stuktur kimianya menggunakan spektroskopi seperti di bawah ini :

a.   Spektroskopi UV

      merupakan metode yang akam memberikan informasi adanya kromofor dari senyawa organik dan membedakan senyawa aromatik atau senyawa ikatan rangkap yang berkonjugasi dengan senyawa alifatik rantai jenuh.

b.   Spektroskopi IR

      metode yang dapat menentukan serta mengidentifikasi gugus fungsi yang terdapat dalam senyawa organik, yang mana gugus fungsi dari senyawa organik akan dapat ditentukan berdasarkan ikatan dari tiap atom dan merupakan bilangan frekuensi yang spesifik.

c.   Nuklir Magnetik Resonansi Proton (NMR)

      metode ini akan mengetahui posisi atom-atom karbon yang mempunyai proton atau tanpa proton. Di samping itu akan dikenal atom-atom lainnya yang berkaitan dengan proton.

d.   Spektroskopi massa

      mengetahui berat molekul senyawa dan ditunjang dengan adanya fragmentasi ion molekul yang menghasilkan pecahan-pecahan spesifik untuk suatu senyawa berdasarkan m/z dari masing-masing fragmen yang terbentuk. Terbentuknya fragmen-fragmen dengan terjadinya pemutusan ikatan apabila disusun kembali akan dapat menentukan kerangka struktur senya yang diperiksa.

d. Uji Bioaktivitas Metabolit Sekunder

            Metabolit sekunder yang dimiliki makhluk hidup baik itu hewan atau tumbuhan mempunyai aktifitas biologis dan ada pula diantaranya yang non aktif. Uji bioaktifitas (bioassay) suatu metabolit sekunder senyawa alam dapat dilakukan secara in vivo maupun in vitro. Prosedur bioassay dari senyawa alam maupun sintetis sangat tergantung pada aktifitas biologis apa yang dicari atau ditapis dari perpustakaan/ database senyawa yang ada.

            Bioassay dengan biaya murah, mudah dan cepat merupakan pilihan untuk menapis senyawa bahan alam, baik penapisan ekstrak kasar maupun dalam penapisan fraksi-fraksi saat isolasi, diantaranya adalah :

1.  Piscidal activity (aktifitas racun terhadap ikan). Salah satu bioassay berdasarkan “brine shrimp bioassay”. Tumbuhan yang mempunyai aktifitas racun bagi ikan juga ditemukan mempunyai aktifitas lain seperti insektisida, inhibitor pertumbuhan tumbuhan, co-karsinogen atau irritant. Dalam hal ini, aktifitas piscidal merupakan marker yang berguna untuk bioaktifitas lainnya.

2.  Uji antimikroba dan antijamur. Bioassay antimikroba dapat dilakukan dengan menguji daya hambat pertumbuhan mikroba dalam medium padat oleh senyawa yang diuji . Metode ini lebih sederhana dan mudah dibanding dengan menguji daya hambat senyawa uji terhadap enzim yang berfungsi dalam sintesis protein, DNA atau dinding sel.

3. Uji antifeedant, uji yang dilakukan untuk mendeteksi senyawa metabolit sekunder yang bersifat aktif biologis terhadap serangga. Ekstrak tumbuhan yang diuji ditambahkan ke dalam makanan serangga kemudian beberapa jenis serangga uji diberi makan dengan diet yang telah dicampur dengan ekstrak uji dan kemudian serangga tersebut dianalisa.

Secara keseluruhan tahap-tahap isolasi, fraksinasi , karakterisasi senyawa metabolit sekunder dan uji bioaktivitasnya adalah seperti terlihat pada bagan berikut ini :